Microscopía confocal

La microscopía confocal es una técnica relativamente nueva que está logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biología, materiales, geología, etc). Aunque el principio de la microscopía confocal fue dado a conocer por Minsk en 1957 y los primeros microscopios basados en esta técnica demostraron su validez en 1968, gracias a los trabajos de Petran y colaboradores; su gran aceptación tuvo lugar hasta hace unos pocos años con el desarrollo de los láseres y equipos de cómputo. Su éxito se debe a las ventajas que ofrece frente a la microscopía óptica convencional (imágenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolución vertical y horizontal, etc) y sobre todo, a la posibilidad de obtener imágenes que permiten su estudio tridimensional (Soto Eguibar, 1993)

El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina una pequeña zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores (Boyde, 1988). La luz procedente de un láser es reflejada mediante un espejo dicroico, y con la lente de un objetivo es enfocada en un punto de la muestra. La señal emitida por el punto iluminado (fluorescencia o luz reflejada) vuelve por el mismo camino óptico, pasando a través del espejo y enfocada en un fotomultiplicador. Por último, un diafragma o "pinhole" es colocado delante del fotomultiplicador para eliminar las señales procedentes de la zona fuera de foco, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen, principalmente en aquellas muestras que tienen diferentes grosores o índices de refracción; en particular los bordes de cualquier estructura.

Fig. 3. Microscopio confocal moderno, su diseño óptico y una imagen de neuronas.
(Wilson et al. 1994).

La microscopía confocal permite estudiar los especímenes usando luz transmitida o reflejada; ello implica que se puedan estudiar muestras que por su grosor o por sus características, no son transparentes. Con ello se han logrado desarrollar nuevas técnicas de preparación de muestras, sin implicar el corte en rebanadas delgadas como se hacía anteriormente, logrando incrementar las posibilidades de estudiar las relaciones estructura-función, ya sea a nivel uni o multicelular.